蘋(píng)果中酵母菌的分離

更新時(shí)間：2018-10-09

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喆圖小編今天來(lái)說(shuō)說(shuō)酵母菌，酵母菌是一些單細(xì)胞真菌，并非系統(tǒng)演化分類(lèi)的單元。酵母菌是人類(lèi)文明史中被應(yīng)用得早的微生物
大多數(shù)酵母菌的菌落特征與細(xì)菌相似，但比細(xì)菌菌落大而厚，菌落表面光滑、濕潤(rùn)、粘稠，容易挑起，菌落質(zhì)地均勻，正反面和邊緣、中央部位的顏色都很均一，菌落多為乳白色，少數(shù)為紅色，個(gè)別為黑色。未發(fā)現(xiàn)其有性階段的酵母菌稱(chēng)假酵母。
大多數(shù)酵母菌為腐生，其生活適pH為4.5-6，常見(jiàn)于含糖分較高的環(huán)境中，例如果園土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生長(zhǎng)迅速，易于分離培養(yǎng)，在液體培養(yǎng)基中，酵母菌比霉菌生長(zhǎng)得快。
利用酵母菌喜歡酸性環(huán)境的特點(diǎn)，常用酸性液體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得酵母菌的培養(yǎng)液（這樣做的好處是酸性培養(yǎng)條件則可抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)），然后在固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)分離之。
酵母菌細(xì)胞的死活可用美藍(lán)進(jìn)行區(qū)別。原因是美藍(lán)為弱氧化劑，無(wú)毒，且還原后變?yōu)闊o(wú)色。如果是活的酵母細(xì)胞，由于新陳代謝不斷進(jìn)行，細(xì)胞內(nèi)氧化還原電勢(shì)頗低，還原力強(qiáng)，若有美藍(lán)染料進(jìn)入活的酵母細(xì)胞內(nèi)，即被還原成無(wú)色，而死的細(xì)胞或代謝緩慢的衰老，由于它們無(wú)還原能力或還原能力弱，仍可被美藍(lán)染成藍(lán)色或淺藍(lán)色。
將少量酵母菌接種到一定體積的、適合的新鮮培養(yǎng)基中，在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，定時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液中的菌量，以菌量的對(duì)數(shù)作縱坐標(biāo)，生長(zhǎng)時(shí)間作橫坐標(biāo)，繪制的曲線(xiàn)叫生長(zhǎng)曲線(xiàn)，它反映了單細(xì)胞微生物在一定環(huán)境條件下于液體培養(yǎng)時(shí)所表現(xiàn)的群體生長(zhǎng)規(guī)律。依據(jù)其生長(zhǎng)速率的不同，一般可把生長(zhǎng)曲線(xiàn)分為延緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。這四個(gè)時(shí)期的長(zhǎng)短因菌種的遺傳性、接種量和培養(yǎng)條件的不同而有所改變。因此通過(guò)測(cè)定微生物的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，可了解各菌的生長(zhǎng)規(guī)律，對(duì)于科研和生產(chǎn)都具有很重要的指導(dǎo)意義。
實(shí)驗(yàn)材料與培養(yǎng)基制備
1，蘋(píng)果、梨等、0.1%美藍(lán)染液、1ml的吸管、無(wú)菌培養(yǎng)皿、試管、高壓鍋、恒溫培振蕩養(yǎng)箱等。
2，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）；
原料：馬鈴薯（80g）、葡萄糖（8g）、瓊脂（4g）、蒸餾水（400ml）。
配制方法：
（1）先將馬鈴薯去皮，切片，稱(chēng)80克并加蒸餾水400ml，煮沸半小時(shí)，用紗布過(guò)濾，補(bǔ)足蒸餾水量至400ml，制成20%的馬鈴薯汁。
（2）在200ml20%的馬鈴薯汁中加入4g瓊脂，4g葡萄糖，煮沸熔化，補(bǔ)足水分并在115℃條件下高壓滅菌20分鐘。制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板。
3，豆芽汁液體培養(yǎng)基：稱(chēng)取黃豆芽50g，加水100ml，煮沸1h，過(guò)濾后補(bǔ)足水分，121℃濕熱滅菌后存放備用，此即為50%的豆芽汁。取50%豆芽汁200ml，葡萄糖50g，水800ml，自然pH，在115℃條件下高壓滅菌20min。
4，YPD培養(yǎng)基：配方：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。配制方法（1000ml配方）：溶解10g酵母膏，20g蛋白胨于900ml水中， 121℃20min高壓滅菌。同時(shí)將20g葡萄糖加入100ml水中，121℃20min高壓滅菌。然后在超凈臺(tái)中兩者混合。
注：葡萄溶液和酵母膏、蛋白胨溶液混合后在高溫下可能會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致培養(yǎng)成分變化，所以要分別滅菌后在混合，但要注意無(wú)菌操作。
實(shí)驗(yàn)步驟
1、接種：取一小塊果皮，不需沖洗，直接接入豆芽汁液體培養(yǎng)基試管中，置28-30℃，培養(yǎng)24h，可見(jiàn)培養(yǎng)液變渾濁。
2、培養(yǎng)，用無(wú)菌吸管取上述培養(yǎng)后培養(yǎng)液0.1ml，注入另一管豆芽汁液體培養(yǎng)基中，置28-30℃再培養(yǎng)24h或稍長(zhǎng)（過(guò)長(zhǎng)則霉菌長(zhǎng)出）。
3、觀察：用無(wú)菌操作法取少許菌液置于載玻片中央的0.1%美藍(lán)染液中，混勻后加蓋玻片制成水浸片，先用低倍鏡后換用高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽生殖情況。活酵母可使美藍(lán)還原，從而使菌體不著色，用此方法可判斷酵母菌的死活。
4、分離：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基溶化后制成平板。用劃線(xiàn)法分離酵母培養(yǎng)液，從而得到單個(gè)菌落。
5、生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定：挑取單個(gè)菌落接種于30mlYPD液體培養(yǎng)基中，30℃、 180r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24h，取擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液的菌液按照1:100的接種量接種于3瓶50mlYPD培養(yǎng)液中，同樣條件下振蕩培養(yǎng)，并分別于培養(yǎng)后2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30h取菌種培養(yǎng)懸液5ml，以未接種的酵母YPD液體培養(yǎng)基校正7200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的零點(diǎn)，在波長(zhǎng)600nm處比色測(cè)定菌液OD600值。以各時(shí)間點(diǎn)菌液的吸光光度值（OD600）為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制出酵母工程的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
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