應用霉菌培養箱進行真菌體內致病性研究：方法與金標準驗證

更新時間：2025-12-02

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摘要：在醫學真菌學研究領域，明確病原真菌的致病性是理解其發病機制、評估治療策略及開發新藥的核心。利用動物模型進行體內感染實驗，被視為驗證真菌致病性的“金標準”。本方案旨在闡述如何系統性地建立并評估真菌動物感染模型，其中霉菌培養箱在關鍵步驟中扮演著的角色，用于量化真菌負荷與評估感染進程。

一、研究目標與核心思路

本研究旨在通過標準的動物感染模型，評估目標真菌菌株（如臨床分離株、基因敲除/過表達株）的體內致病能力強弱。核心思路是：將真菌以特定方式接種于易感動物，隨后通過一系列終點指標（生存率、組織載菌量、病理損傷），客觀、定量地比較不同菌株的毒力差異。整個過程高度依賴于霉菌培養箱對回收真菌的準確培養與計數。

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二、動物感染模型的建立

實驗動物選擇：

常用模型：小鼠是泛使用的模型動物。根據研究目的，可選擇免疫正常的野生型小鼠，或免疫缺陷小鼠（如中性粒細胞減少癥模型、Cyclophosphamide處理小鼠），后者對條件致病真菌（如曲霉、念珠菌）更為敏感，能模擬免疫功能低下宿主的嚴重感染。

感染方式與途徑：

全身播散性感染模型：通過尾靜脈注射一定濃度的真菌孢子或酵母細胞懸液。此模型用于研究真菌的全身性定植、擴散能力及對抗真菌藥物的全身療效。

侵襲性肺曲霉病模型：通過鼻腔吸入或氣管內接種孢子懸液。這是研究見侵襲性真菌病——侵襲性肺曲霉病的經典模型。

皮膚或皮下感染模型：在剃毛皮膚表面涂抹或進行皮下注射，用于研究皮膚癬菌或皮下真菌病的致病過程。

三、致病性評估的核心指標與方法

感染模型建立后，需通過以下多維度的指標進行系統評估：

生存率分析：最直接、力的終點指標。

方法：設立對照組（如PBS注射）與實驗組（接種不同菌株），每日觀察并記錄動物的生存狀態。

數據分析：繪制Kaplan-Meier生存曲線，使用Log-rank檢驗比較不同組間的生存率差異。生存期顯著縮短的組別，其感染菌株的毒力更強。

組織器官真菌載量定量分析：關鍵量化指標，依賴霉菌培養箱完成。

方法：在感染后設定的時間點（如24h, 48h, 72h, 7天）處死動物，無菌采集目標器官（肺、肝、脾、腎、腦等）。

勻漿與培養：將組織稱重后加入無菌PBS進行勻漿。取適量勻漿液進行系列稀釋，涂布于選擇性固體培養基（如含氯霉素的SDA平板）上。

霉菌培養箱的作用：將涂布后的平板置于霉菌培養箱中，在適宜真菌生長的溫度（通常25-30℃或37℃，視菌種而定）下培養24-72小時。

結果判定：計數平板上的菌落形成單位，并根據稀釋倍數和器官重量，計算每克組織中的CFU數量。載菌量越高，表明真菌在該組織中的增殖和定植能力越強。

組織病理學分析：直觀顯示真菌-宿主相互作用的形態學指標。

方法：取部分組織用福爾馬林固定，石蠟包埋后切片。

特殊染色：采用過碘酸希夫染色（PAS）或六胺銀染色（GMS），這些染色能特異性地將真菌細胞壁染成紅色或黑褐色，使其在組織背景下清晰可見。

鏡下觀察：在光學顯微鏡下評估：

真菌侵襲程度：菌絲/孢子在組織中的分布范圍、深度。

菌絲形態：觀察體內菌絲形態是否與體外培養一致。

宿主反應：炎癥細胞浸潤類型（中性粒細胞、巨噬細胞等）、組織壞死、肉芽腫形成等病理變化。

四、霉菌培養箱在本研究中的核心價值

在整個研究鏈條中，霉菌培養箱并非僅是一個培養工具，而是實現定量化、標準化評估的基石：

精準定量：通過提供穩定、均一的培養環境，確保從組織中回收的真菌能夠可靠地形成可見菌落，使得CFU計數準確可靠，這是比較不同菌株或不同處理組間毒力差異的客觀數據基礎。

標準化操作：所有組織樣本在相同的培養條件下處理，避免了因培養條件波動引入的誤差，保證了實驗結果的重復性與可比性。

結論：綜合利用動物模型與霉菌培養箱等關鍵技術，建立系統的體內致病性研究方案，是解析真菌毒力因子、評估新型抗真菌藥物或宿主導向療法效能的黃金法則。其中，霉菌培養箱在將“感染”這一生物學過程轉化為可精確測量的“數據”（CFU/g組織）方面，發揮著不可替代的核心作用，為真菌致病機理研究與防控策略開發提供了堅實的技術支撐。

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